Избавит ли мир от детского паралича программа искоренения полиовируса?

Был ли вообще выделен полиовирус?

В современной медицине существует догма, что полиовирус выделен, описан, полностью изучен и ныне близок к исчезновению благодаря агрессивным вакцинно-искоренительным программам. Однако, как показала недавняя вспышка в Доминиканской Республике, мы можем быть не так близки к искоренению полиомиелита, как нас хотят в этом убедить.

Более того, хотя агент, идентифицируемый как полиовирус, был культивирован в конце 1940-х, знаем ли мы наверняка, что он был действительно выделен, т.е. выращен в чистом виде без примесей? Мы знаем, что случайные вирусы («попутчики»), как например SV40, часто встречаются в тканях обезьяны, которые первые исследователи полиовируса использовали в качестве клеточной культуры. И хотя эти агенты, очевидно, не приносили никакого вреда обезьянам, отсроченное влияние их на человека еще предстоит определить.

Примерно через 90 лет после сообщения Ландштейнера и Поппера об успешном заражении обезьян полиомиелитом, д-р Вольфганг К. Йоклик вернулся к великим научным достижениям XX века с точки зрения определяющей науки последнего, вирусологии19. Поводом послужили совпавшие 100-летние юбилеи Американского общества микробиологии и собственно вирусологии. Работая главным редактором «Вирусологии» и редактором «Журнала вирусологии» после долгой карьеры в качестве профессора микробиологии, Йоклик имел уникальную возможность (как он сам отмечал) оценить, что же нового узнали со времен первых опытов по вирусологии.

Перед основанием «Вирусологии» и «Журнала вирусологии» в 1950-х и 1960-х гг. соответственно, Йоклик отмечал «ряд эпохальных открытий в вирусологии», появившихся в журналах другой тематики. Среди семи выделенных им открытий были два, связанных с исследованием паралича. Первым было «открытие Эндерса и соавт. в 1949 г., что вирус полиомиелита может быть выращен на клеточных тканях человеческого эмбриона, культивированных in vitro, что создало основу техники выращивания на тканевой культуре (моноклеточной культуре)». Вторым — "Дульбекко, также в 1952 г., продемонстрировал, что вирус животных был способен формировать пятна в монослоях клонированных клеточных культур, и это открыло область молекулярной вирусологии животных"19. И хотя само исследование Дульбекко в 1952 г. не включало в себя полиовирус, оно напрямую привело его к работе 1954 г., в которой он применил новую методологию к изучению полиовируса8,9.

В 1949 г., как рассказывал Йоклик, исследователь с медицинского факультета Гарвардского университета Джон Ф. Эндерс со своими коллегами Томасом Г. Веллером из Службы общественного здравоохранения США и Фредериком К. Роббинсом, старшим членом Национального исследовательского совета по вирусным заболеваниям, продемонстрировали не только способность полиовируса расти на клеточных культурах, но и его способность размножаться вне нервных тканей — в то время это было ошеломляющим открытием13. Уже подозревали, что полиовирус часто присутствует в кишечнике заболевших людей. Однако никому не удавалось размножить вирус в тканях кишечного тракта, главным образом из-за бактерий, которые естественным образом живут там. Успех частично сопутствовали Эндерсу и его коллегам, потому что они добавили антибиотик (пенициллин или стрептомицин) в свои клеточные культуры, чтобы убить бактерии — техника, которая, разумеется, до второй мировой войны была недоступна исследователям.

Несмотря на то, что работа Эндерса и его коллег 1949 г. общепризнана как поворотный пункт в исследовании полиомиелита (многие, в том числе исследователи из ВОЗовской программы искоренения полиомиелита, воздают должное ей как проложившей путь для разработки полиовакцин Сэбина и Солка), полиовирус не был выделен и этими исследователями. Они успешно вырастили на эмбриональных тканях «фильтрующиеся агенты», которые они считали полиовирусом. Как Ландштейнер и Поппер 40 годами ранее, и как почти все исследователи в этой области в течение первых примерно 60 лет, Эндерс и его сотрудники называли эту передающую заболевание суспензию «вирусом».

Несмотря на это преувеличение, Эндерс, Веллер и Роббинс первыми доказали, что инфекционный агент, связанный с полиомиелитом, может быть выращен в клетках в лаборатории, и что клеточные культуры могут заменить живых животных для изучения таких передающихся агентов. В 1954 г. за эту новаторскую работу им была присуждена Нобелевская премия.

Считается, что работа Ренато Дульбекко 1952 г., отмеченная Йокликом, внесла весомый вклад в вирусологию вообще и в исследование полиовируса в частности. Работая в Калифорнийском технологическом институте в Пасадене, Дульбекко разработал метод выращивания клеток в чашках Петри таким образом, что «вирусные пятна» стали видны. Он вырастил пятна вируса западного лошадиного энцефаломиелита на субстрате куриных эмбриональных клеток и в опубликованной статье указал, что по-прежнему неизвестно, все ли вирусы можно ли культивировать подобным образом. Это было самое начало современных исследований в вирусологии, и Дульбекко выразил надежду, что однажды исследователи смогут различать различные вирусы, выращенные на клеточной культуре, используя его методологию и исследуя образовавшиеся пятна под микроскопом9.

Эксперимент Дульбекко по «выделению»

В 1954 г. Дульбекко и его коллега Маргарет Фогт опубликовали классическую исследовательскую статью, которая, как считается, на десятилетия вперед установила стандарт очистки полиовируса. В ней было представлено техническое нововведение в процесс «очистки» вирусов от тканевой культуры. Новая техника была названа «очисткой пятна». Отдельное пятно (область клеток округлой формы, окрашенная иначе, чем окружающая культура) предлагалось считать популяцией чистого вируса. В очистке пятна использовалась трипсинизация, которая включает в себя обработку клеток, в данном случае клетки обезьяньей почки, ферментами трипсина, расщепляющими любую образовавшуюся группу клеток, в результате чего получали моноклеточную суспензию.

На заре исследований полиовируса тканевая культура обычно извлекалась из обезьяньих почек (или обезьяньих яичек). Дульбекко и Фогт объяснили, откуда взялся «вирус», который они вырастили:
"Вирус поставлялся в виде 20% суспензии спинного мозга макаки резус в дистиллированной воде. Использовался 1-й тип вируса, полученный пассажем через однослойные почечные культуры. 2-й тип, штамм Йель-Эс-Кей (Yale-SK), и тип 3, штамм Леон (Leon), в форме надосадочных клеточных культур любезно предоставил д-р Дж. Л. Мельник"9.

Другими словами, Дульбекко и Фогт не выделили полиовирус в чистом виде ни в одном из экспериментов, описанных в этом докладе 1954 г. Хотя они писали о засевании своих культур «вирусом», на самом деле они использовали неочищенные суспензии, а не чистые вирусные изоляты.

Как только обезьяньи почки измельчались до «отдельных клеток, клеточных кластеров и клеточных осколков», их засевали эмульсией обезьяньего спинного мозга. Появление пятен свидетельствовало о росте вируса, согласно модели, разработанной Дульбекко в 1952 г.8

Проверкой эксперимента была обработка культур обезьяньей антисывороткой (полученной от обезьян, зараженных 1-м, 2-м или 3-м типом полиовируса); если антисыворотка 1-го типа подавляла образование пятен, а антисыворотки для 2-го и 3-го типов нет, то считалось, что в культуре присутствует только полиовирус 1-го типа. Другими словами, было принято считать, что никакие другие организмы или связанные с заболеванием агенты не размножались на культуре.

Еще раз: то, что Дульбекко и Фогт описывают как «выделение» полиовируса, не является выделением с точки зрения современной микробиологии. Чтобы произвести «очистку пятна», они просто набирали пипеткой немного жидкости («пятносодержащего препарата») на пластинке с одной культурой и добавляли на пластинки с другими культурами. Когда клеточные культуры второго поколения очевидно демонстрировали рост вируса (т.е. пятен), обезьяны прививались пятносодержащим препаратом. У привитых обезьян развивался паралич и впоследствии большинство умирали. Поскольку препарат с пятнами очищенного вируса не только давал рост новых пятен во втором поколении клеточных культур, но и вызывал вялый паралич у обезьян, Дульбекко и Фогт сделали вывод, что они «выделили» полиовирус.

Ясно, что как и предыдущие исследователи полиовируса, Дульбекко и Фогт размножали в своих тканевых культурах связанные с заболеванием вещества, и что они переносили эти вещества обезьянам, у которых развивался вялый паралич. Это были впечатляющие достижения.

Заявления Дульбекко и Фогт, однако, шли дальше того, что позволяли факты. Они утверждали, что не только выделили полиовирус, но и что «поскольку каждый пятносодержащий препарат происходил от моновирусной частицы (как доказано в „Дискуссии“), эти препараты являются самыми чистыми источниками вируса, доступными в настоящее время».

Почему же они решили, что «моновирусная частица», которую они никогда не видели и не измеряли, вызвала рост именно одного пятна на их культуре? В доказательство того, что каждое пятно произошло от моновирусной частицы, Дульбекко и Фогт приводили математическое уравнение: они установили зависимость определенной концентрации вируса в клеточной культуре от количества разведений первоначальной жидкости (например, суспензии обезьяньего спинного мозга). Чем меньше раз была разведена жидкость, тем больше пятен вырастало в лабораторных культурах. Чем больше раз разводилась жидкость, тем меньше пятен росло. Математическая модель Дульбекко и Фогт предполагала такую линейную зависимость между разведением пятносодержащего препарата и числом образующихся пятен, и когда они достигали наибольшего разведения, при котором все же формировалось одно пятно, они считали, что там присутствовала лишь одна «вирусная частица». И что же стало обещанным доказательством этого? Их математическая модель. Это прекрасный пример тавтологического доказательства. Его самым очевидным слабым звеном является то, что математическая модель не различала и не могла различить «моновирусную частицу» и биологический комплекс, который мог содержать моновирус.

Это становится ясно из описания, данного Дульбекко и Фогт пятнообразующей «моновирусной частице», которую они считали выделенной:

"Теперь стало возможным дать правильную характеристику вирусной частице, обнаруживаемой при помощи пятна. Благодаря эффекту «все или ничего», она имеет признаки частицы. Это соответствует единице вируса, которая не поддается дальнейшему разделению при высоких разведениях. Исходя из этого определяющего свойства, мы назвали это пятнообразующей частицей. Мы не знаем ее морфологические или генетические свойства. Это может быть единичный микроорганизм, или их группа, при условии, что группа неопределимо присутствует при высоких разведениях…"8.

Сегодня кажется странным, что Дульбекко и Фогт допускали возможность того, что они обнаружили «группу» материалов, а потом игнорировали это. Что, если другой вид вируса также присутствовал в этих частицах? Или генетический материал хозяина присоединялся к частице, формируя «группу»?

И хотя электронный микроскоп, который позволил бы им увидеть моновирусную частицу, существовал в 1954 г., Дульбекко и Фогт не воспользовались им. Вместо этого, они применили испытанную временем технологию, согласно которой считалось, что вирусы присутствуют в культуре, если определенные химикаты окрашивали ее соответственно, или если жидкости, предположительно содержащие вирусы, демонстрировали стандартный рост характеристик, как например связанные с полиовирусом пятна, описанные здесь. Дульбекко и Фогт не могли определить, что они наблюдали отдельные вирусы в культурах, и поэтому их предположение, что они выделили «моновирусную частицу», было большим преувеличением. Дульбекко и Фогт не выделили полиовирус.

Из этого исторического обзора первых докладов об исследовании полиовируса становится ясно, что никто из исследователей полиомиелита на самом деле не выделил полиовирус. Кроме того, они вводили обезьянам экспериментальные жидкости, которые, возможно, были заражены другими связаннными с болезнью агентами.

Еще больше искажает картину тот факт (не рассматриваемый в настоящей статье), что кроме полиовируса есть и другие энтеровирусы, связанные с ОВП. Например, не далее как в феврале 2001 г. было продемонстрировано, что вирус Коксаки А-24 связан с ОВП неполиовирусного происхождения5.

Страницы: 1 2 3 4 5 6

Вы можете оставить комментарий, или ссылку на Ваш сайт.

Оставить комментарий